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Ag百家乐时间差 Nature | 北京大学魏文胜团队发布新一代线粒体碱基裁剪器助力建造疾病动物模子
发布日期：2024-01-30 07:04 点击次数：82
转自：生物谷Ag百家乐时间差
核基因组突变是多种疾病的根源，而线粒体行动细胞内具有半自主功能的细胞器，领有孤独的基因组，其基因组突变一样与多种遗传疾病密切干系。线粒体疾病频繁累及多种组织器官，其中最为东说念主熟知的包括Leigh笼统征和LHON（Leber遗传性视精神病变）。
Leigh笼统征的症状包括发育慢慢、肌张力减退、通顺和呼吸逼迫等，而LHON则进展为观点丧失、中央暗点和视神经萎缩等问题。笔据MITOMAP的统计，现在已考据的线粒体致病性突变有97个，其中点突变占比高达95%。关联词，由于枯竭有用的点突变干系线粒体疾病小鼠模子，线粒体疾病的谈判与调养设备受到了严重制约。
早期的小鼠模子主要通过化学引导或遗传工程构建[1]，但这些范例操作复杂、资本昂贵且对突变的精确截止较差，仅成效建造了少量数模子。频年来，谈判东说念主员成效设备了线粒体碱基裁剪用具，不错对线粒体DNA结束C到T和A到G的裁剪，举例DdCBEs和TALEDs。这些用具基于双链DNA脱氨酶DddA卵白[2,3]。天然已有谈判者尝试将这些用具应用于小鼠模子的构建，但其裁剪遵循尚不及以模拟东说念主类线粒体疾病中高突变负荷的特征[4,5]。
此外，谈判标明DdCBEs可能激发大批核基因组脱靶效应，这种非TALE依赖性的脱靶主要源于DddA卵白的自拼装以偏执与CTCF的相互作用[6]。因此，基于DddA的线粒体碱基裁剪用具在应用中濒临核基因组脱靶的风险，难以凯旋建造线粒体突变与疾病表型之间的因果筹谋。
针对这一挑战，北京大学魏文胜课题组之前设备了mitoBEs，这是一种衔尾切口酶与单链DNA脱氨酶的新式线粒体碱基裁剪用具，简略结束线粒体DNA的C到T和A到G裁剪。与DdCBEs和TALEDs比拟，mitoBEs展现出超卓的链特异性和权臣裁汰的脱靶效应。收货于其双向碱基裁剪才智，mitoBEs简略对大要87%的致病线粒体突变进行精确建模[7]。
2025年1月22日，北京大学及昌平本质室魏文胜课题组在Nature杂志在线发表了题为“PrecisemodellingofmitochondrialdiseasesusingoptimizedmitoBEs”的谈判论文。该谈判报说念了通过优化后的mitoBEs结束高效且精确地构建线粒体疾病小鼠模子的恶果。诓骗优化版mitoBEs，谈判团队成效建造了具有高突变频率的小鼠模子，这些模子进展出了与疾病干系的典型表型。此外，通过杂交本质，还得到了突变负荷达到100%以及仅含单碱基突变的精确小鼠模子。
为准确建造突变与疾病表型之间的凯旋筹谋，排斥碱基裁剪用具的脱靶效应尤为蹙迫。在诓骗mitoBEs进行建模时，需要将RNA编码的mitoBEs打针到小鼠受精卵中。因此，该谈判最初对RNA编码的mitoBEs系统的脱靶效应进行了全面评估。收尾标明，RNA编码的mitoABE存在庸碌的转录组脱靶效应，而mitoCBE则进展出一定进度的依赖于APOBEC1卵白的线粒体基因组脱靶效应。为了晋升mitoBEs的精确性，AG真人百家乐线路该谈判要点优化了脱氨酶。针对mitoABE，通过突变筛选发现，TadA8e-V106W-V28F简略权臣裁汰转录组脱靶至配景水平（图1）。针对mitoCBE，筛选了多种现存的胞嘧啶脱氨酶，并发现TadA养殖的胞嘧啶脱氨酶CBE6d在线粒体基因组上进展出的脱靶效应接近配景水平。
基于这些优化恶果，谈判团队将改造后的mitoBEs定名为mitoBEsv2，包括mitoABEv2和mitoCBEv2（图1）。此外，该谈判还系统性地评估了优化前后mitoBEs在核基因组上的脱靶效应，收尾泄露，不管是优化前已经优化后的mitoBEs，均未在核基因组上激发显着的脱靶效应，从而考据了其在基因裁剪中的安全性和可靠性。
图1 优化mitoBEs的裁剪精确性
通过将85个东说念主类致病性线粒体DNA点突变与小鼠线粒体基因组进行同源性比对，谈判详情了70个可裁剪位点。进一步的细胞水平初步筛选成效结束了其中68个位点的裁剪。比较发现，由环状RNA（circRNA）编码的mitoBEsv2比拟于mRNA编码的用具，具有更高的裁剪遵循。因此，谈判团队将circRNA编码的mitoBEsv2打针至小鼠胚胎并进行移植，收尾泄露mitoBEsv2在多种F0代小鼠模子中均结束了较高的裁剪遵循，其中mt-Nd5A12784GF0小鼠模子的突变频率高达82%（图2）。
此外，该谈判系统性评估了F0代小鼠在线粒体基因组和核基因组中的脱靶效应，收尾标明，在悉数基因组边界内未检测到脱靶效应。这一发现标明，mitoBEsv2简略构建遗传配景干净的线粒体疾病小鼠模子。更蹙迫的是，线粒体基因组的裁剪收尾在小鼠不同组织中进展出庸碌且捏久的存在（图2），况且简略通过母系遗传踏实传递。通过进一步杂交本质，谈判成效得到了主义位点裁剪遵循达到100%以及仅含主义位点突变的mt-Nd5A12784G小鼠模子。
图2 mitoBEs v2高效构建线粒体疾病小鼠模子，裁剪收尾庸碌且捏久踏实于多组织
mt-Atp6T8591C和mt-Nd5A12784G分辨对应东说念主类线粒体致病突变m.T9191C和m.A13379G，并分辨导致Leigh笼统征和LHON。谈判团队对突变率较高的F0代小鼠进行了疾病表型评估，收尾泄露，mt-Atp6T8591C小鼠进展出权臣的腹黑功能逼迫，与Leigh笼统征的临床特征相符；mt-Nd5A12784G小鼠则进展出访佛LHON的观点逼迫（图3）。
此外，谈判还通过改变TALE衔尾位点，成效构建了仅含主义位点裁剪的单碱基突变mt-Nd5A12784G小鼠模子。这些谈判收尾充领会释了mitoBEv2在创建线粒体疾病小鼠模子方面的高效性和精确性，为潜入探索线粒体疾病的致病机制及设备新式调养战略提供了蹙迫用具。
图3 小鼠模子呈现出相应的线粒体疾病表型
北京大学博士后伊宗裔为该论文的共同通信作家，昌平本质室博士后张小雪为论文的第一作家，张雪、任纪武、李佳怡、魏晓旭和于莹博士也为该谈判作念出了蹙迫孝顺。本谈判得到了昌平本质室、国度天然科学基金、北大-清华生命科学荟萃中心及中国博士后科学基金的资助。
著作流通:
https://www.nature.com/articles/s41586-024-08469-8
参考文件：
1.Stewart,J.B.,CurrentprogresswithmammalianmodelsofmitochondrialDNAdisease.JournalofInheritedMetabolicDisease,2021.44(2).
2.Mok,B.Y.,etal.,AbacterialcytidinedeaminasetoxinenablesCRISPR-freemitochondrialbaseediting.Nature,2020.583(7817).
3.Cho,S.I.,etal.,TargetedA-to-GbaseeditinginhumanmitochondrialDNAwithprogrammabledeaminases.Cell,2022.185(10).
4.Silva-Pinheiro,P.,etal.,Alibraryofbaseeditorsforthepreciseablationofallprotein-codinggenesinthemousemitochondrialgenome.NatureBiomedicalEngineering,2023.7(5).
5.Cho,S.I.,etal.,EngineeringTALE-linkeddeaminasestofacilitateprecisionadeninebaseeditinginmitochondrialDNA.Cell,2024.187(1).
6.Lei,Z.X.,etal.,Mitochondrialbaseeditorinducessubstantialnuclearoff-targetmutations.Nature,2022.606(7915).
7.Yi,Z.Y.,etal.,Strand-selectivebaseeditingofhumanmitochondrialDNAusingmitoBEs.NatureBiotechnology,2024.42(3).
（转自：生物谷）Ag百家乐时间差